一、介紹

高壓液相色譜（HPLC）是分析化學和生物化學中常用的一種方法，用于將混合物中的化合物進行分離，以便進一步分析和純化。

在HPLC過程中，混合物中的組分通過被泵送的溶劑（稱為流動相）穿過裝有硅基顆粒的柱子（稱為固定相）來實現分離。每種組分（稱為分析物）根據其在流動相和固定相之間的獨牛寺親和力，以不同的速度沿柱遷移，并在不同的時間從柱中流出，從而實現混合物的有效分離。

對流動相具有較高親和力的分析物會沿著柱子遷移得更快，而對固定相具有較高親和力的分析物則遷移得更慢。這種遷移時間（稱為保留時間）對于每個分析物都是獨牛寺的，可以用于其鑒定。通過在柱后適當使用檢測方法，每個分析物也可以被定量分析。

較小的柱填料顆粒尺寸可以提高色譜分辨率，但需要增加溶劑輸送壓力。進一步減小柱填料顆粒尺寸可以允許更高的溶劑流速，從而在不犧牲分辨率的情況下減少分析時間。這正是超高效液相色譜（UHPLC）相對于其他液相色譜技術的優勢所在。

基本類型的高效液相色譜柱化學：

• 正相色譜，例如硅膠顆粒

• 反相色譜，例如涂有C-18的硅膠

基本的流動相輸送系統類型：

• 等度洗脫 - 使用恒定溶劑混合物，例如在整個分離過程中使用10%的水在甲醇中。

• 梯度洗脫 - 隨時間變化的溶劑混合物，例如從純己烷開始，然后逐漸增加乙酸乙酯的濃度，直到最后為純乙酸乙酯。

高效液相色譜系統的基本組件包括溶劑輸送泵、樣品進樣口、柱子和檢測器。高效液相色譜的性能要求儀器具有典型液相色譜系統所不具備的特性。溶劑輸送必須是無脈沖的，并且在1毫升/分鐘到100微升/分鐘的流量范圍內準確校準。

注射泵通常被認為優于活塞泵，適用于需要低且穩定流速的高效液相色譜應用。Teledyne ISCO注射泵是這些高性能應用的優秀高效液相色譜泵。

圖1：等度溶劑輸送系統

二、理論

Van Deemter方程是理解色譜法基本原理的關鍵。根據Van Deemter方程：

H = A + B/µ + Cµ

其中：H是柱子的板高，µ是流動相的線性流速。A、B和C是常數。較小的板高H表示更高的分離分辨率。²

常數A是渦流擴散項。渦流擴散是由于柱中多條流動路徑導致的，并且與流動相流速無關。由于填料顆粒的存在，分析物分子可以沿著不同長度的多條路徑前進。這些不同長度的多重路徑使分析物分子分散開來，并導致峰展寬。A項取決于固定相的緊密程度。固定相中的空隙會因通道效應導致峰展寬。相比之下，較小的填料顆粒提供更小的路徑長度差異，從而減少峰展寬。

B是縱向擴散系數。它依賴于分析物分子在流動相中的擴散系數。更快的流動相流速減少了停留時間，而分析物分子在柱中的較短停留時間減少了縱向擴散的影響。這種減少有助于提高分離效率，因為分析物分子通過擴散散開的機會更少，這解釋了1/v因子。

C是分析物質量傳遞系數。它取決于分析物分子在移動相和固定相之間達到平衡所需的時間。如果這種平衡太慢，那么一些未能及時與固定相結合的分析物分子將會隨流動相流下柱；而那些未能及時從固定相脫離的其他分子則被留下。更高的流動相流速會導致分析物分子的擴散，因此解釋了v因子。較小的固定相顆粒預計會有更短的平衡時間。

如上所述，較小的固定相顆粒或珠子應該會降低A和C值。A項對H的貢獻較小，允許更高的分辨率。隨著C項對H值的影響變得不那么顯著，增加流動相流速不會太多犧牲分離性能。這將允許在相同的分辨率下進行更快的分離。盡管較小的柱珠可能不會直接影響B值，但較高的流速減少了其對H的貢獻。較小的柱珠將允許在更高分辨率下進行更快的分離。³

較小的珠子將以較小的間隙填充，從而減小A值，但提供更高的溶劑流動阻力。反過來，這需要更高的溶劑壓力。隨著蕞優分離流速的增加，柱背壓隨固定相顆粒尺寸的立方成反比增加；即P∝1/d3。⁴通常，對于5 µm柱珠的HPLC需要1,000 psi的壓力，而對于1.7 µm柱珠的UHPLC則需要20,000 psi或更高的壓力。^1,4

圖2：梯度溶劑輸送系統

三、HPLC泵

往復式泵通常配有單活塞或雙活塞。活塞掃過的體積通常較小，約為100 µL。由于體積小，需要頻繁補充液體，導致周期性壓力下降。雙活塞泵比單活塞泵產生更平穩的流動，但并非總是理想的選擇。注射泵蕞適合要求高壓、無脈沖和精確流動的高性能應用。注射泵具有更大的缸體容積，高達1 L，并且在運行期間通常不需要重新填充。因此，基線更加穩定，沒有周期性的壓力下降。理想的泵應能夠在等度或梯度模式下操作。

表1：常用推薦的HPLC泵

四、引用

1) Y. Shen and R.D. Smith, Electrophoresis 23 (2002) pp. 3106-3124.

2) D.A. Skoog and D.M. West, Fundamentals of Analytical Chemistry, 3rd edit., pp. 643-649.

3) D. Sievers, M.E. Swartz and B.J. Murphy, G.I.T. Laboratory Journal 5(2004) pp.43-45.(2004) pp. 503-504

4) L.A. Colon, J.M. Cintron, J.A. Anspach, A.M. Fermier and K.A. Swin-ney, The Analyst 129

5) L.R. Snyder, J.J. Kirkland and J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2nd edit., pp. 41-43.

6) J.C. Giddings, Dynamics of Chromatography: Part I Principles and Theory (Marcel Dekker, Inc., New York: 1965) pp. 25-26, 229-230.

7) J.M. Cintron and L.A. Colon, The Analyst 127 (2002) pp. 701-704.A.D. Jerkovich, J.S. Mellors and J.W. Jorgenson, LCGC 21 (July 2003) pp. 600-611.